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糞腸球菌探針法熒光定量PCR試劑盒說明書

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糞腸球菌探針法熒光定量PCR試劑盒說明書

1、 試劑盒簡介貨為了適應(yīng)糞腸球菌探針法快速檢測和疫病研究的需要,本公司參照 OIE 標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的引物序列,經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)及系統(tǒng)優(yōu)化,開發(fā)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測具有快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確、安全操作簡單、應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)。2、試劑盒組成:

試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增試劑,具體組成參見表 1:

表 1:試劑盒組成(50test/盒)

*保存條件:樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。

3、樣本采集,存放及運(yùn)輸

3.1 樣本采集

所用取樣器材必須經(jīng)過高壓滅菌并烘干。取對蝦的腮絲、肝胰腺、腹肢等組織各30mg標(biāo)記后置于離心管中,按照試劑盒配套的DNA抽提試劑盒操作說明提取DNA模板。

3.2 存放

研磨后的樣本應(yīng)盡快提取 DNA;待測樣本應(yīng)避免凍融。

3.3 運(yùn)輸

采用或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。

4、檢測步驟

4.1.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進(jìn)行):

取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管,其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和,對每個管進(jìn)行編號標(biāo)記。(注:試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板,無需提取核酸)

4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1,然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl,一份樣本換用一個吸頭;混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃~25℃條件下,12 000 r/min 離心 10 min。

4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀,再加入 10µl DNA 提取液 2,混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃~25℃ 條件下,2 000 r/min 離心 10 s。

4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min;加入 90µl DEPC 水,12 000 r/min 離心 10 min,吸取上清, 即為提取的 DNA,冰上保存待用(提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存)。

4.1 PCR 檢測

4.1.1 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備(在反應(yīng)混合物配制區(qū)進(jìn)行):

從試劑盒中取出相應(yīng)的 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶,2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應(yīng)體系配制見下表 2。

表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表

                          

4.1.2 加樣(樣本處理區(qū)進(jìn)行):

向每個 PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液,再分別加入樣本 DNA 模板 10μL,蓋緊管蓋,500

r/min 離心 30 s。

4.1.3 PCR 檢測(在檢測區(qū)進(jìn)行): 階段,95 ℃/3 min;

第二階段,94 ℃/30 sec,60 ℃/30sec;72℃/1 min;35個循環(huán);

第三階段,72 ℃/7 min; 第四階段,4 ℃ 保存

4.3 瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備 1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽,使電泳緩沖液剛好沒過膠面,向 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 1/6 體積的電泳上樣緩沖液(6X 上樣緩沖液),按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設(shè)立 DNA DL2000 Marker 做對照。5 V/cm 電泳約 0.5h,當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)一定位置時停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴(kuò)增出預(yù)期的特異性 DNA 電泳帶,拍攝并記錄。

5、結(jié)果判定

5.1 PCR 后,陽性對照會出現(xiàn)一條 196bp 的 DNA. 片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。

5.2 待測樣品 PCR 擴(kuò)增后能在相應(yīng) 196 bp DNA 位置上有帶,可判為 BP 核酸陽性。

6、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-GAT-CTG-CAA-GAG-GAC-AAA-CC-3’

R: 5’-TAC-CCT-GCA-TTC-CTT-GTC-GC-3’

 

 
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